La presente sperimentazione pubblicata sulla rivista Molecules mira ad investigare l’attività antiossidante del CBD addizionato a due differenti matrici oleose, confrontando i risultati con quelli ottenuti per le medesime matrici addizionate con α-tocoferolo [1].

I Composti antiossidanti

Il cannabidiolo (CBD) è un cannabinoide non psicoattivo presente nella Cannabis sativa L. [2]. Dalla struttura chimica del CBD (Figura 1), si notano due gruppi fenolici che potrebbero determinarne un’attività antiossidante [3]. Secondo Borges et al. 2013 [4], il CBD ha, infatti, una potenziale attività antiossidante grazie alle strutture di risonanza nelle quali l’eventuale elettrone spaiato viene delocalizzato sull’anello. 

Figura 1. Struttura chimica del CBD e dell’α-tocoferolo.

Un comune ed importante antiossidante è l’ α-tocoferolo (Figura 1), componente chiave nei sistemi biologici in quanto si integra nelle membrane cellulari e ne protegge i lipidi in esse contenuti [5]. 

Sono molti i saggi che possono essere utilizzati per valutare l’attività antiossidante in vitro ed uno dei più noti è il saggio di inibizione del DPPH. Il DPPH è un radicale libero abbastanza stabile, caratterizzato da un colore viola intenso ed assorbimento a 520 nm in soluzione alcolica. Quando viene miscelato con una sostanza che può donare un elettrone, il DPPH dà origine alla forma ridotta e perde il tipico colore viola [6]. Il viraggio di colore è alla base della visualizzazione del saggio per valutare l’attività antiossidante. 

Quando essa viene valutata è essenziale considerare che il metodo fornisce un risultato in relazione al meccanismo di azione, alle molecole target, al pH, al tempo e alle condizioni di temperatura; inoltre, vengono utilizzati diversi standard per costruire le curve di calibrazione che producono risultati diversi in termini di attività antiossidante.

Pertanto, nessun singolo saggio di “attività antiossidante” in vitro potrà mai riflettere la reale capacità antiossidante [7,8], ma tutte le possibili misure hanno un significato parziale strettamente correlato al metodo di misura e allo standard utilizzato. Inoltre, gli antiossidanti possono rispondere in modo diverso a varie fonti di radicali o molecole ossidanti [9].

Anche l’attività degli antiossidanti dipende non solo dalle loro caratteristiche strutturali, ma anche da altri fattori, quali concentrazione, temperatura, substrato e stato fisico del sistema, nonché dai numerosi microcomponenti che agiscono come pro-ossidanti o in sinergia [9]. Grassi e oli sono particolarmente sensibili ai complessi processi di ossidazione, che producono radicali liberi e/o altre specie reattive come intermedi [10]. Spesso gli oli vengono utilizzati come mezzi per l’assunzione di farmaci o integratori (ad esempio il CBD), per questo motivo è fondamentale la valutazione del loro stato ossidativo e dell’eventuale attività antiossidante che può svolgere il CBD in queste matrici. 

I radicali liberi, che si formano per ossidazione dei lipidi, hanno un’azione negativa sia negli alimenti, sia nei sistemi biologici [5]. Sono responsabili o coinvolti in processi degenerativi, primo tra tutti l’invecchiamento cellulare [11]. Per questo vengono introdotti con la dieta degli antiossidanti che svolgono un ruolo importante di contenimento dei radicali liberi [5]. 

Materiali e metodi 

La capacità antiossidante di CBD (purezza 99,8%, in forma di cristalli forniti da Enecta) e α-tocoferolo (purezza 97%) è stata valutata in soluzioni oleose preparate utilizzando olio di oliva raffinato secondo la farmacopea europea (Ph Eur) e olio di girasole raffinato a tre diverse concentrazioni: 0,01%, 0,1% e 0,5 % (Figura 2).

Figura 2. Piano di campionamento ed analisi effettuate.


Risultati e discussione dello Studio

Sono stati scelti due oli raffinati, poiché il processo di raffinazione elimina la maggior parte dei composti antiossidanti che sono presenti in queste matrici e perché sono gli ingredienti che vengono utilizzati, di norma nelle preparazioni alimentari e farmaceutiche.

Inoltre, è stato possibile confrontare due oli caratterizzati da un profilo diverso in acidi grassi: l’olio di oliva è principalmente caratterizzato da acido oleico mentre quello di girasole che è stato impiegato presentava come componente preponderante l’acido linoleico, quindi più insaturo. Al fine di poter effettuare dei confronti, tutte le analisi sono state eseguite anche sui campioni di olio utilizzati come matrice. 

La determinazione del contenuto di CBD e dell’α-tocoferolo dopo estrazione era quantitativa, il che significa che entrambi i composti si sono solubilizzati a tutte le concentrazioni utilizzate per le prove. 

L’olio di girasole, inizialmente, aveva un contenuto di perossidi maggiore rispetto all’olio di oliva raffinato, il che significa che si trovava in uno stadio di ossidazione più avanzato. Inoltre, è stato osservato che, a tutte le concentrazioni studiate, un aumento della concentrazione del principio attivo (CBD o α-tocoferolo) ha determinato un aumento del numero di perossido. 

I valori relativi all’acidità libera (Tabelle 1 e 2) mostravano minime fluttuazioni (incrementi o riduzioni) con l’aggiunta di CBD e di α-tocoferolo all’olio di oliva e girasole, per lo più all’interno della variabilità analitica.

Il tempo di ossidazione forzata (OSI, Tabelle 1 e 2) registrato per l’olio d’oliva raffinato era più alto di quello relativo all’olio di semi di girasole e questo dato è in linea con le diverse composizioni in acidi grassi; l’olio di girasole, infatti, presenta un maggior contenuto in acidi grassi insaturi, molto più sensibili all’ossidazione.

Per quanto riguarda le matrici oleose addizionate di CBD, i risultati hanno mostrato una riduzione del tempo di ossidazione forzata (OSI) con l’aggiunta del principio attivo. Tali risultati sono in accordo con quanto emerso dalla determinazione del numero perossido.

L’aggiunta, invece, di α-tocoferolo ha determinato un aumento del tempo di ossidazione forzata (OSI) nei campioni di olio di semi di girasole. Al contrario, è stata rilevata una leggera riduzione di questo tempo con l’aggiunta di α-tocoferolo allo 0,01% ed allo 0,1% all’olio di oliva raffinato. In accordo con quanto riscontrato in letteratura l’attività dell’α-tocoferolo può essere antiossidante e, in certe condizioni, pro-ossidante [12]; talvolta, inoltre, non si è riscontrata una correlazione positiva tra l’analisi del tempo di induzione ed il contenuto totale di tocoferolo [13,14].

Tabella 1. Risultati relativi alla determinazione del numero di perossido, acidità libera e resistenza all’ossidazione forzata (OSI) degli oli addizionati con CBD. 

Tabella 2. Risultati della determinazione di numero di perossido, acidità libera e resistenza all’ossidazione forzata (OSI) degli oli addizionati con α-tocoferolo. 

I dati ottenuti dall’analisi ESR, che quantifica i radicali presenti, effettuata sull’olio di oliva raffinato e sull’olio di girasole addizionati con CBD hanno mostrato come questo composto possa avere un leggero effetto pro-ossidante alle concentrazioni più basse (0,01% e 0,1%). Tuttavia, quando la concentrazione era pari allo 0,5%, il CBD mostrava invece un’azione antiossidante, determinando una diminuzione dei radicali liberi.

I risultati del test ESR sull’olio di oliva raffinato e sull’olio di girasole addizionati con α-tocoferolo hanno messo in luce una marcata azione antiossidante di questo composto, in particolare a concentrazioni dello 0,1 e 0,5%.

Il saggio di attività radicale di DPPH ha evidenziato che aumentando la concentrazione di CBD, si ha un marcato aumento della capacità di rimozione dei radicali (scavenging), infatti, in accordo con quanto riscontrato in letteratura, il CBD è in grado di spegnere efficacemente il radicale DPPH [15] (Figura 3). I dati hanno mostrato una maggiore attività di scavenging del CBD anche rispetto all’α-tocoferolo. 

A questo proposito è essenziale evidenziare, però, che il valore dell’EC50 (concentrazione di antiossidante necessaria per ridurre del 50% la concentrazione del radicale DPPH) non è sempre utile per comprendere l’attività anti-radicalica di un composto in un sistema modello durante la sua ossidazione, come indicato anche da Foti, 2015 [16]. Infatti, molti composti reagiscono rapidamente con DPPH e più lentamente con i radicali perossidici, presenti nei sistemi reali [16]. 

Figura 3. Istogrammi relativi alla determinazione del valore EC50, risultato dal saggio dell’attività di “radical scavenging” eseguita con il test DPPH.

Il valore del numero di perossido è aumentato all’aumentare sia della concentrazione di CBD che di α-tocoferolo, mentre l’attività di radical scavenger più rilevante si è registrata con il CBD. Questa apparente contraddizione, ossia la mancanza di correlazione tra questi due saggi è stata segnalata anche in studi precedenti [17,18].

Conclusioni

Nei due sistemi modello considerati, che differivano per composizione in acidi grassi e stato ossidativo iniziale, sono state messe in luce differenze interessanti. Il numero di perossido che misura l’ossidazione primaria è aumentato, probabilmente in relazione all’ossigenazione, subito dopo la preparazione/miscelazione delle soluzioni oleose ed è apparso evidente un effetto pro-ossidante del CBD, confermata dalla riduzione del tempo di ossidazione forzata (OSI). Al contrario l’aggiunta di α-tocoferolo ha mostrato un’azione antiossidante e un incremento del tempo di ossidazione forzata (OSI).

In termini di radicali liberi, il test ESR non ha mostrato una riduzione rilevante della loro concentrazione dovuta all’aggiunta di CBD, mentre si è registrata una riduzione significativa della concentrazione di radicali liberi con l’aggiunta dell’α-tocoferolo.

Il test DPPH ha evidenziato una maggiore attività radical scavenger del CBD rispetto all’α-tocoferolo che, però, non sembra correlata ad una maggiore stabilità ossidativa della soluzione oleosa corrispondente. Come sottolineato in letteratura, l’utilizzo  del test DPPH per confrontare la possibile attività antiossidante di molecole diverse è discutibile. Per fornire un quadro esaustivo è necessario indagare a fondo ed una per una le concentrazioni di uso del CBD, perché questo composto può avere un effetto antiossidante o pro-ossidante.

In merito alle soluzioni oleose considerate, più o meno insature (girasole e oliva), è essenziale notare come il CBD non abbia mostrato un’attività antiossidante, né un’azione protettiva, se aggiunto fino allo 0,5%. E’ quindi fondamentale, nella preparazione di soluzioni oleose di CBD considerare la possibilità di introdurre un antiossidante (ad esempio α-tocoferolo), oppure utilizzare un olio vergine di oliva naturalmente ricco in polifenoli dotati, come noto, di una azione straordinariamente protettiva.

BIBLIOGRAFIA

  1. Tura, M., Mandrioli, M., Gallina Toschi, T. (2019). Preliminary Study: Comparison of Antioxidant Activity of Cannabidiol (CBD) and α-Tocopherol Added to Refined Olive and Sunflower Oils. Molecules, 24(19), 3485. 
  2. Fouad, A.A.; Albuali, W.H.; Al-Mulhim, A.S.; Jresat, I. (2013). Cardioprotective effect of cannabidiol in rats exposed to doxorubicin toxicity. Environ. Toxicol. Pharmacol., 36, 347–357.
  3. Iuvone, T.; Esposito, G.; De Filippis, D.; Scuderi, C.; Steardo, L. (2009). Cannabidiol: A promising drug for neurodegenerative disorders? CNS Neurosci. Ther., 15, 65–75.
  4. Borges, R.; Batista, J.; Viana, R.; Baetas, A.; Orestes, E.; Andrade, M.; da Silva, A. (2013). Understanding the molecular aspects of tetrahydrocannabinol and cannabidiol as antioxidants. Molecules, 18, 12663–12674.
  5. Beddows, G.; Jagait, C.; Kelly, M.J. (2000). Preservation of alpha-tocopherol in sunflower oil by herbs and spices. Int. J. Food Sci. Nutr., 51, 327–339.
  6. Molyneux, P. (2004). The use of the stable free radical diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for estimating antioxidant activity. Songklanakarin J. sci. technol, 26(2), 211-219.
  7. Granato, D.; Shahidi, F.; Wrolstad, R.; Kilmartin, P.; Melton, L.D.; Hidalgo, F.J.; Elmore, S. (2018). Antioxidant activity, total phenolics and flavonoids contents: Should we ban in vitro screening methods? Food Chem., 264, 471–475.
  8. Apak, R.; Gorinstein, S.; Böhm, V.; Schaich, K.M.; Özyürek, M.; Güçlü, K. (2013). Methods of measurement and evaluation of natural antioxidant capacity/activity (IUPAC Technical Report). Pure Appl. Chem., 85, 957–998.
  9. Gülcin, I. (2012). Antioxidant activity of food constituents: An overview. Arch. Toxicol., 86, 345–391. 
  10. Shahidi, F.; Zhong, Y. (2010). Lipid oxidation and improving the oxidative stability. Chem. Soc. Rev., 39, 4067–4079.
  11. Michniak-Kohn, B., & Leonardi, G. R. (2017). An overview about oxidation in clinical practice of skin aging. An. Bras. Dermatol., 92(3), 367-374.
  12. Wagner, K.H.; Elmadfa, I. (2000). Effects of tocopherols and their mixtures on the oxidative stability of olive oil and linseed oil under heating. Eur. J. Lipid Sci. Technol., 102, 624–629.  
  13. Baldioli, M.; Servili, M.; Perretti, G.; Montedoro, G.F.  (1996). Antioxidant activity of tocopherols and phenolic compounds of virgin olive oil. J. Am. Oil Chem. Soc., 73, 1589–1593.
  14. Sabolová, M.; Johanidesová, A.; Hasalíková, E.; Fišnar, J.; Doležal, M.; Réblová, Z. (2017). Relationship between the composition of fats and oils and their oxidative stability at different temperatures, determined using the Oxipres apparatus. Eur. J. Lipid Sci. Technol., 119, 1600454.
  15. Hayakawa, K.; Mishima, K.; Nozako, M.; Ogata, A.; Hazekawa, M.; Liu, A.X.; Fujioka, M.; Abe, K.; Hasebe, N.; Egashira, N.; et al. (2007). Repeated treatment with cannabidiol but not Δ9-tetrahydrocannabinol has a neuroprotective effect without the development of tolerance. Neuropharmacology, 52, 1079–1087.
  16. Foti, M.C.  (2015). Use and Abuse of the DPPH• Radical. J. Agric. Food Chem., 63, 8765–8776.
  17. Sielicka, M.; Małecka, M.; Purłan, M. (2014). Comparison of the antioxidant capacity of lipid-soluble compounds in selected cold-pressed oils using photochemiluminescence assay (PCL) and DPPH method. Eur. J. Lipid Sci. Technol., 116, 388–394.
  18. Kemerli-Kalbaran, T.; Ozdemir, M. (2019). Multi-response optimization of oil extraction from pine nut (Pinus pinea L.) by response surface methodology: Extraction efficiency, physicochemical properties and antioxidant activity. LWT, 103, 34–43.

Autrici:

Tullia Gallina Toschi 

Professoressa presso il Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agro-Alimentari, Alma Mater-Studiorum, Università di Bologna.

Matilde Tura

Dottoranda presso il Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agro-Alimentari, Alma Mater-Studiorum, Università di Bologna.